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亚硫酸氢盐修饰技术


       DNA经亚硫酸盐预处理后,重亚硫酸盐对未甲基化的胞胞嘧啶的脱氨基的速度要远高于5-甲基胞嘧啶,非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸盐影响,保持不变。亚硫酸盐将表观遗传学事件转化为基因组的变化,通过区分后者就可间接判断样品中的胞嘧啶甲基化与否。

        DNA甲基化分析通常需要对DNA进行硫化转化修饰。提取的游离DNA经过硫化试剂作用,DNA上未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,再通过特异性的引物和探针进行PCR即可得到目的基因的甲基化情况及水平。目前市场上常见的甲基化硫化方法大部分都是使用亚硫酸氢钠作为硫化试剂。亚硫酸氢钠极其难溶,配制不方便且浪费时间,而且其硫化强度较弱,硫化所需时间较长,一般需要2-3个小时甚至是过夜。

        重亚硫酸盐转化需要苛刻的化学条件才能将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶,而苛刻的化学条件会导致DNA降解,所以在转化效率、DNA稳定性、操作时间、DNA产量等方面,要想达到一个最佳的平衡,不是一件容易的事情。目前市面上大部分的亚硫酸盐转化试剂盒仍然采用传统的氢氧化钠变性、亚硫酸盐高温转化及脱磺酸基和脱盐。但是长时间的高温低pH处理会导致DNA的严重降解。对于含量极低(不高于1%)、片段极短(平均160bp)且本身极易降解(血液中平均半衰期2h)的循环肿瘤DNA,降解将会更加严重,导致无法进行后续的相关操作。

1   亚硫酸氢盐修饰原理

1)Step1:将DNA(对纯净度哟一定要求)进行变形,通常使用95℃处理10min即可,使得DNA双链变为单链;2)Step2:使用低PH值亚硫酸氢盐对DNA的胞嘧啶进行修饰,通常需要数小时,可在水浴锅或PCR仪中进行。3)Step3:修饰过后需要进行脱磺处理,通常需要在强碱下。

2   亚硫酸氢盐修饰步骤

        向含有100微升DNA溶液的2mL离心管中分别加入150微升亚硫酸氢盐溶液和30微升保护液,涡旋混匀,短暂离心,80℃下恒温孵育60分钟,孵育结束后,立即取出离心管,短暂离心,经过结合、漂洗、脱磺、漂洗、洗脱得到修饰后的DNA溶液。

3    亚硫酸氢盐修饰组分

1)修饰液:亚硫酸氢铵,一般40-60%,亚硫酸氢钠,一般2-15%,TritionX-100,一般0.2- 0.8%,其余为水,pH值在5.3~5.6;2)保护液,四氢呋喃糠醇80-90%,D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸(TPGS)10-15%,乙酸四氢糖酯0.20-0.30%,乙氧基黄叱精0.02-0.08%,其余为水;

3)纯化结合液:异硫氰酸胍20-30%,Trition X-100 13%,1,2-丙二醇4%,乙二醇乙醚乙酸酯0.3%,乙醇30-40%,三羟甲基氨基甲烷0.8%,其余为水;

4)使用磁珠或硅胶柱;磁珠悬浮液为40-60 mg/ml的纳米磁性颗粒的水悬浮液,超顺四氧化三铁颗粒或超顺三氧化二铁颗粒,且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被。

5)纯化脱磺液,由0.3-0.5mol/L氢氧化钠、75%~85%乙醇和水组成;

6)纯化漂洗液,为75%~85%的乙醇溶液。

4    亚硫酸氢盐修饰优缺点

1)优点:为DNA甲基化检测最为成熟、稳定的检测方法;下游检测技术可使用NGS、QPCR、质谱等;优化后的试剂转化率可大于99.9%,过转化率小于0.001%;转化后甲基化与未甲基化模板有较大的碱基差别,较为利于后续检测;检测假阳性率较低。

2)缺点:检测较为繁琐,为了取得较好的成果,甚至需要过夜处理;处理易造成DNA降解;纯化会损失一部分DNA;转化后DNA会有连续的U出现,增大了后续检测难度。



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