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核酸质谱(MALDI-TOF MS)


1. MALDI-TOF MS原理

质谱技术的基本原理是通过样品离子化,产生不同质荷比的离子,然后再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分子量,并按照从小到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱。质谱仪器平台虽然种类众多,但可以通过样品进样方式、离子源、质量分析器等方面进行简易分类。其中,MALDI-TOF MS采用的是样品与基质混合进样,激光解吸方式电离以及飞行时间方法进行质量分析。目前仪器灵敏度达到500 fmol,采用标准样品牛血清白蛋白(BSA)进行测定,分辨率达到50以上。

2.基质

MALDI-TOF MS需要基质参与电离的过程,基质多为具有很强激光能量吸收能力的有机酸,其主要作用为增强样品对激光的吸收,并在一定程度上降低激光对样品的破坏。基因检测所选用的基质通常为羟基吡啶甲酸(HPA)。

3.离子源工作原理

样品与基质混合结晶后,在激光的照射下基质迅速蒸发,基质和样品分子间的作用力快速削弱,使得样品分子被释放出来。同时,基质可将吸收到的激光能量传递至样品分子并使其电离。因此,MALDI技术属于光子激发的表面解吸离子源,其能量由激光的光子提供。另外,MALDI电离技术灵敏度极高,仅需pmol~fmol级别的微量样本即可进行检测。

4.飞行时间质量分析器(TOF MS)原理

飞行时间质量分析器最早出现于1955年,20世纪80年代后期开始快速发展,并常与MALDI离子源联用。其原理是通过间歇式的脉冲电场对离子化的样品进行加速,然后不同分子量的离子在真空飞行管内以各自不同的恒定速度飞向离子检测器。由于真空管内离子飞行速度与其质荷比(m/z)的平方根成反比,不同质荷比的离子到达检测器的飞行时间不同,从而可以区分出样品中具有不同分子量的物质。理论上,TOF分析器的相对分子质量检测范围为0至无限大,但在实际基因检测应用中该检测范围多限制在1 000~10 000区间。

早期的TOF MS分辨率较低,主要原因是当时所采用的离子连续引出技术存在缺陷,即同时离开离子源的相同m/z离子间的动能存在差异。后续Wiley和Mclaren在20世纪50年代开发了延迟引出(DE)技术,离子化后的样品首先进入无场区,然后在几百纳秒或几微秒的延迟后加上电压脉冲引出离子,纠正了具有相同质荷比离子的能量离散,增强了TOF分析器的分辨率。但是,延迟引出的方式每次只能对分子量相对较低的部分进行优化,对高质量区无效,因此研究者提出了另一种采用反射器提高分辨率的方法。该方法通过引入一个迟滞场可以偏转离子并将其送回飞行管中,该迟滞场位于与离子源相对的自由场的后面,并将检测器设置在迟滞场的一侧用于捕获被反射的离子。反射器可以修正相同质荷比离子的动能偏差,使得不同动能的离子在同一时间到达检测器,从而达到提高分析器的分辨率的效果。与延迟引出技术的弱点相比,反射器对高质量区离子同样可以进行优化,但代价是损失灵敏度和缩小质量范围。由于基因检测多集中于1000~10000区间,属于低质量区,因此检测时主要采用带有延迟引出技术的线性模式。

5.DNA甲基化检测

在人类基因组中,约3%~6%的胞嘧啶都会在DNA甲基化转移酶的作用下与甲基基团结合并在CpG二苷酸的C′5位碳上形成共价键。CpG二苷酸在人类基因组中常以大小为300~3 000 bp的密集形式存在(CpG岛),而这些CpG岛通常位于基因的转录起始位置附近,具有调控基因表达的功能。CpG岛的异常甲基化水平升高会抑制相关基因的表达,造成该基因所代表的蛋白质水平急剧下降。近年来,DNA甲基化在肿瘤研究领域受到了极大的关注,特别是CpG岛高甲基化所导致的抑癌基因转录失活及异常低甲基化所致原癌基因的激活已成为肿瘤研究中的热点问题,除此之外DNA甲基化还与印记缺陷、精神分裂症、抑郁狂躁型忧郁症等复杂疾病有一定相关性。

目前常见的甲基化检测方法主要有测序、甲基化特异性PCR、荧光定量PCR等方法。相比之下,质谱DNA甲基化检测,在引物设计、检测成本及数据分析等方面更加便捷、快速和准确。其主要检测步骤可分为4个部分,第一步是通过亚硫酸氢盐反应对基因组DNA进行处理,目的是将序列中未甲基化的C转化为U,而甲基化的C保持不变。第二步是利用5′末端带有T7启动子序列的引物对目标CpG岛区域进行PCR扩增,并在扩增后加入虾碱性磷酸酶处理残余dNTP。随后,利用RNA转录酶对扩增产物进行转录并在第四步对转录产物进行尿嘧啶特异性酶切处理。上述步骤完成后,样品中未甲基化的C最终变为A,而甲基化的C最终变为G,然后质谱可根据G和A之间16 Da的分子量差异检测出甲基化和未甲基化的C并通过各自的峰面积计算该CpG位点甲基化比例,并估算整个检测片段内的平均甲基化水平。由质谱带来的这种快速、准确、定量甲基化检测新技术有助于推进肿瘤发生机制的研究,提升临床诊疗水平。质谱平台灵敏度高,可检测低至5%的甲基化水平,特异性良好。

 


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