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甲基化特异PCR(MS-PCR)

                           

实验原理

    MSP法的原理是基于DNA经亚硫酸氢钠处理后,所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。基于这种碱基的改变,然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,最后通过荧光定量、琼脂糖电泳等,确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。这种方法适于研究少两样本的DNA片段,具有方便快捷,灵敏度高的优点,是目前较为常用的甲基化检测方法。

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检测流程

(1)DNA抽提

    用DNA抽提试剂盒抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

(2)重亚硫酸盐处理

(3)DNA纯化

    纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。

(4)DNA脱磺基反应

(5)甲基化特异性的PCR反应

    针对改变后的DNA序列设计两对引物(M,U),进行PCR反应。

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检测仪器

      Roche罗氏LightCycler® 480,ABI 7500。

优点

(1)避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题;

(2)敏感性高;

(3)稳定好;

(4)操作简单,检测仪器设备简单,一般实验室均可开展。

缺点

(1)检测已知序列靶标DNA;

(2)引物探针设计对于检测较为重要;

(3)若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡,则检测时较为复杂;

(4)这种方法只能作定性研究,即只能明确是否存在甲基化;若要求定量,则需用其他的方法进行进一步检测;

(5)存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置,并且需要反复摸索找出合适的反应时间。

 




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