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DNA羟甲基化


甲基化胞嘧啶(5-methylated cytosine, 5mC)被称之为人类DNA的第5种碱基。已有的研究结果表明,人类基因组CpG(CpG islands)5mC可以通过影响染色质的结构与功能而影响相关基因的表达水平,在发育与疾病发生过程中具有重要作用。最近,研究者又在哺乳动物中发现了被称之为DNA6种碱基的一种表观遗传学新修饰,即5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)。目前,5hmC的生物学功能尚不是很清楚,但是,初步研究结果表明,它在基因表达的调控过程中具有较为重要的作用,正在成为当前表观遗传学领域的研究热点之一。

1.1 5hmC5mC的相关性

DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNA methytransferase, DNMT)的作用下,在基因DNA序列CpG二核苷酸(CpG dinucleotides,基因序列中 5'3'方向紧随相连的 CG碱基,即5'-CG-3')的胞嘧啶5'-碳位共价键结合一个甲基基团( -CH3)而形成5mC5-hmC5-mC的羟基化形式,1952年在噬菌体DNA中首次发现。5mC转变成5hmC的关键酶是10-11易位 (ten-eleven translocation, TET)家族蛋白。TET蛋白具有加氧酶(dioxygenase)结构域,在铁离子(Fe2+)与α酮戊二酸(2-oxoglutarate, 2OG)存在的条件下,可以把5mC氧化为5hmC。动物实验发现,在DNMT1Np95/Uhrf1基因敲除的小鼠胚胎干细胞(embryonic stem, ES)5hmC含量显著少于野生型小鼠ES细胞,而在DNMT1DNMT3aDNMT3b三基因敲除的小鼠ES细胞中5hmC几乎全部消失,提示并证实了5hmC来源于之前存在的5mC

1.2 5hmC的生物学功能预测

1952年研究者在噬菌体DNA中首次发现5hmC以来,5hmC的功能研究一直围绕着它对于噬菌体DNA的保护作用。直至最近,研究者才发现它在人和小鼠大脑以及胚胎干细胞中广泛存在,5hmC的功能研究也成为当前表观遗传学领域的研究热点之一。5hmC的功能还知之甚少,但普遍认为它参与了DNA基因表达调控或去甲基化。  

DNA甲基化所致相关基因沉默的机制之一是甲基化胞嘧啶结合蛋白(methylcytosine binding proteins, MeCP)与甲基化DNA结合并形成复合物,该复合物诱导染色质组蛋白脱乙酰基(deacetylation)而导致染色质构象改变,最终抑制基因转录。5hmC能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(methyl-CpG binding domain, MBD)与甲基化DNA的亲和性,提示5hmC具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能。目前多个实验室报道了5hmC与基因转录活性相关性研究结果,但结论不一致:5hmC富含基因与其转录水平不相关、正相关或负相关。因此,5hmC水平与相关基因转录活性之间的相关性还有待于进一步的研究与证实。另外,也有研究提示5hmCDNA去甲基化过程中的中间产物,但因缺乏直接证据未得以证实。近来研究发现,将TET1转染到细胞中进行表达,某些5mC转化为了5hmC,而某些则逆转为普通的胞嘧啶(cytosine, C);将另一种脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽1 (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like 1, APOBEC1)转染到细胞中表达时,发现脱甲基化过程得以进一步增强。随后,研究者发现DNA中的5mC转化为5hmC,二者都可以被TET蛋白氧化为5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine, 5caC),而5caC又进一步被胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine-DNA glycosylase, TDG)识别并切除,进而通过DNA剪切修复途径替换为没有修饰的C,从而初步阐明了一条DNA主动去甲基化的途径(5mC 5hmC5caCC),为研究DNA去甲基化作用及生理功能指明了方向。

2 5hmC检测的方法学

目前尽管已经有检测DNA甲基化的多种分析技术,如重亚硫酸盐修饰(bisulfite modification)和甲基化DNA免疫沉淀(methylated DNA immunopreci-pitation, MeDIP)等,但这些技术均不能区分5mC5hmC,例如,在重亚硫酸盐修饰过程中,5mC5hmC都会被转变成尿嘧啶,从而在后续的检测方法中无法识别二者。近年来,随着分子生物学检测技术的不断发展,目前,不仅可探测特定位点的5hmC,而且还能分析基因组5hmC的水平及其分布特征。

2.1 特定位点5hmC检测技术

是一类可分析特定基因或序列位点5hmC状态的分析技术。目前市场上出现了可探测特定位点5hmC商品化试剂盒,主要是NEB公司的EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis KitZymo Research公司的Quest 5-hmC Detection Kit。它们的检测原理大致相同,均是首先将5hmC特异性地转变成β-葡萄糖基-5羟甲基胞嘧啶 (β-glucosyl-5-hydroxymethylcy-tosine, β-glu-5hmC or 5ghmC),然后再基于甲基化敏感限制性内切酶(methylation sensitive restriction enzyme, MSRE)及其同裂酶识别和扩增5-ghmC5mC所在基因片段。具体步骤如下。第一步是糖基化。用T4-葡萄糖基转移酶(T4-β-glucosyltrans-ferases, T4-BGT)处理基因组DNA,使所有5hmC的羟基上添加葡萄糖(glucose)转换为5ghmC,未修饰胞嘧啶或5mC则不受影响,从而将5ghmC 5mC区分开来。第二步的是限制性内切酶消化。MspIHpaII识别相同的序列(CCGG),但是对不同的甲基化状态敏感。其中MspI识别并切割未修饰胞嘧啶或5mC5ghmC除外,HpaII则识别并切割未修饰胞嘧啶,5mC5ghmC则不受影响。第三步是PCR扩增和分析不同限制性内切酶的消化产物。基因组DNA先经糖基化,接着MspI消化后检测到的是5ghmC 含量,HpaII消化后检测到的是5mC5ghmC总量,未经酶消化后检测的是DNA总量。上述两款试剂盒的区别在于前一款包含了MspI,而后一款不包含对5-ghmC敏感的限制性内切酶。内切酶处理之后,可开展多种下游分析,如qPCR、新一代测序、Southern杂交、芯片等。此类试剂盒的优点是操作简便,只需三步。

2.2 全基因组5hmC检测技术

全基因组5hmC检测检测技术目前主要有两类,分别是依赖抗原-抗体免疫作用原理的沉淀检测技术和不依赖于上述原理的非沉淀检测技术。依赖于免疫原理的沉淀检测技术是利用一些酶和化学反应的组合来分离出包含单个5-hmCDNA片段,然后采用沉淀或免疫沉淀技术可达到对5hmC的特异性分析。该类技术主要包括5hmC免疫沉淀(5hmC immunoprecipitation, 5hmC-IP)、抗5-亚甲基磺酸胞嘧啶(antiserum to cytosine 5-methy-lenesulphonate, anti-CMS)、结合蛋白J(J-binding protein, JBP)沉淀、糖基化、高碘酸氧化和生物素化(glucosylation, periodate oxidation,biotinylation, GLIB)处理等5hmC-IP是目前研究5hmC较为常用的方法之一,也是较其他沉淀技术更为直接的方法。5hmC-IP采用的5hmC特异抗体能够使5hmC直接免疫沉淀,具有良好的灵敏性。anti-CMS是基因组DNA经重亚硫酸氢钠,将5hmC转换成5-亚甲基磺酸胞嘧啶(cytosine 5-methylenesulphonate, CMS),然后利用CMS特异抗体免疫沉淀CMS DNA序列。JBP沉淀是5hmC T4-BGT作用下转换为β-glu-5hmC,然后磁珠偶联JBP将其沉淀。GLIB是利用T4-BGT 5hmC转换为5ghmC,然后用高碘酸钠氧化葡萄糖,它将邻近的羟基转化成醛基,之后用醛基反应性探针进一步修饰,在每个5hmC上添加两个生物素分子,并利用链霉亲和素来沉淀。与5hmC-IP相比,选择性标记5hmC后再对标记物进行免疫沉淀则具有不依赖5hmC的浓度和更高灵敏度的特点。不依赖于沉淀的检测技术主要包括薄层色谱法(thin-layer chromatography)、高压液相色谱法(high-pressure liquid chromatography)、质谱法(mass spectro-metry)5hmC葡萄糖基化定量测定(Quantitative hmC glucosylation assay)、单分子实时DNA测序(single-molecule real-time DNA sequencing, SMRT)和选择性化学标记SMRT技术。前三种方法因不适用于大样本实验检测而受到限制。5hmC葡萄糖基化定量测定是在T4-BGT作用下在5hmC上添加一个放射性标记3H的葡萄糖,然后采用液体闪烁计数器进行检测。其特点是不依赖于特定的设备,不产生序列偏倚,并且所需样本量小。SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法,属于第三代核酸测序技术。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中,核苷酸的掺入产生荧光脉冲,然后依据荧光颜色鉴定出核苷酸,当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时,脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间与DNA聚合酶的动力学相关,根据5mC5hmC 等各种修饰对聚合酶动力学的影响不一,从而能够将它们区分和检测。选择性化学标记SMRT是利用第三代单分子测序技术和5hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5hmC。首先5hmC T4-BGT作用下转换为N3-5-gmC,之后通过生物素连接、磁珠富集和二硫键断裂一系列反应生成HS-N3-5-gmC,最后SMRT测序。与单纯SMRT技术检测5hmC相比,由于动力学信号的大幅增加,在单分子读取中可准确指定5hmC的位点,而无需与未修饰的对照样品进行比较。

3 5hmC在人体组织学分布特征及其在疾病状态下的变化特征

研究者首次对人体正常组织中5hmC分布进行研究,发现人体不同类型组织中5hmC分布存在差异性,在脑组织中含量最高(0.67),肝脏(0.46)、肾脏(0.38)、结肠(0.45)、直肠(0.57)组织含量次之,肺脏组织含量较低(0.14),胎盘(0.06)、心脏、乳腺(0.05)组织含量最低。随后的研究也发现5hmC分布具有组织特异性,脑组织5hmC含量十分丰富,尤其是大脑皮质。这与5hmC在小鼠不同组织中的分布相似。最近,Nestor等报道推测5hmC水平与组织增殖率有关,低增殖能力组织中5hmC含量较高,高增殖能力组织中5hmC含量较低。Haffner等研究发现,5hmC水平与组织细胞分化程度存在相关性,终末分化细胞中5hmC含量最高,干细胞或者元祖细胞中5hmC含量较低。Szulwach等通过绘制小鼠在3个不同年龄阶段小脑和海马2个脑区域中5hmC的模式图谱,揭示了在发育和衰老过程中5hmC是随着年龄维持在稳定状态或逐渐增长的分布模式;该研究小组还发现,5hmC水平与MeCP蛋白含量存在负相关性,提示5hmC可能在雷特综合征(Rett syndrome)和孤独症等神经障碍性疾病的发生发展起着重要作用。LiLiu的研究还发现,结肠癌和直肠癌组织中5hmC含量明显降低。在HeLa宫颈癌细胞系、HCT116 SW620结肠癌细胞系及 AN3CA 子宫内膜癌细胞系中几乎检测不到5hmC。在后来的研究中相继发现在其他肿瘤组织中5hmC含量降低。Jin等报道肺癌组织中5hmC含量降低,大脑肿瘤组织中5hmC水平减少更为明显,几乎不到正常组织含量的1/30,同时在皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、胰腺癌、小肠癌、肝癌和肾脏肿瘤组织中5hmC含量也明显降低,结果推测肿瘤组织5hmC含量降低与肿瘤细胞高增殖率有关,并且肿瘤组织中5hmC生成与消除过程存在着异常。Haffner等发现前列腺癌、乳腺癌和结肠癌组织中5hmC水平显著降低,研究结果提示5hmC可能在肿瘤发生和发展过程中起一定阻碍作用,其机制可能为5hmC通过改变DNA甲基化状态来阻止肿瘤抑制基因和凋亡基因失活,5hmC水平的降低使得上述基因缺乏保护导致肿瘤发生发展起着重要作用。LiLiu的研究还发现,结肠癌和直肠癌组织中5hmC含量明显降低。在HeLa宫颈癌细胞系、HCT116 SW620结肠癌细胞系及 AN3CA 子宫内膜癌细胞系中几乎检测不到5hmC。在后来的研究中相继发现在其他肿瘤组织中5hmC含量降低。Jin等报道肺癌组织中5hmC含量降低,大脑肿瘤组织中5hmC水平减少更为明显,几乎不到正常组织含量的1/30,同时在皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、胰腺癌、小肠癌、肝癌和肾脏肿瘤组织中5hmC含量也明显降低,结果推测肿瘤组织5hmC含量降低与肿瘤细胞高增殖率有关,并且肿瘤组织中5hmC生成与消除过程存在着异常。Haffner等发现前列腺癌、乳腺癌和结肠癌组织中5hmC水平显著降低,研究结果提示5hmC可能在肿瘤发生和发展过程中起一定阻碍作用,其机制可能为5hmC通过改变DNA甲基化状态来阻止肿瘤抑制基因和凋亡基因失活,5hmC水平的降低使得上述基因缺乏保护导致肿瘤发生。

4 结论

5hmCTET家族的酶通过氧化5mC产生的,可能参与了DNA去甲基化或基因表达调控,具有重要的生物学作用。但5hmC与肿瘤关系的研究尚处于初步探索阶段,肿瘤组织中5hmC水平显著降低,并且不同肿瘤组织中5hmC含量变化不同,说明其可能在肿瘤发生和发展过程中起一定作用,在不同来源的肿瘤发生过程中发挥作用的方式及调控机制可能不同。目前确切的作用和分子机制尚不十分清楚,5hmC在肿瘤组织中含量的改变可能与其在肿瘤细胞甲基化率及增殖率等机制的调控有关。随着5hmC甲基化分析和检测方法学的发展,人们将进一步揭示5hmC与肿瘤发展进程的相关性。5hmC作为一种表观遗传学新修饰, 在肿瘤中的特异性使其有望成为肿瘤早期诊断和肿瘤患者预后的标志物。


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