DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下,基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5\'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。

DNA Methylation

DNA 甲基化

在基因组的某些区段,CpG保持或高于正常概率,这一区域我们称之为CpG岛(CpG islandCpG岛常位于基因转录调控区附近,与56%的人类基因组编码基因相关,因此基因转录区CpG岛的甲基化状态的研究就显得十分重要。人类基因组序列草图分析结果表明,人类基因组CpG岛约为28890个,大部分染色体每1Mb就有5-15个CpG岛,平均值为每Mb含10.5个CpG岛,CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。



表观遗传学的概念基于遗传学而来,不是单纯的体外在环境导致的甲基化和乙酰基化改变,也不是简单转录因子和miRNA等等基因调控,它的指的是由非DNA变异而改变表型的‘可遗传的’现象。现在众多所谓的表观遗传学研究实际上都没有跳出经典遗传学的定义。



  DNA Methylation and Cancer

DNA甲基化与肿瘤

肿瘤诊断

DNA methylation and Diagnosis of tumor

DNA甲基化与肿瘤诊断

来自于加州大学圣地亚哥分校医学院、中山大学肿瘤防治中心、西京医院等研究机构的科研团队发现,DNA甲基化至少可以为4种常见癌症提供有效的分子标记,不仅仅可以准确诊断肿瘤组织,还可以作为预后的重要指标,该研究结果《DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of commoncancers》于《PNAS》期刊在线发表。

研究团队在3种不同的数据库中分析4种常见癌症(肺癌、乳腺癌、结肠癌和肝癌)与正常人的DNA甲基化信息差异,并进行3组列队分析,分别为1619例肿瘤组织和173例正常组织,791例肿瘤组织和93例正常组织,来源于中国人群394例肿瘤组织和324例正常组织。他们发现,DNA甲基化检测能够检测癌症,且相较于传统组织活检,准确率达到95%。此外,甲基化检测还能够准确识别97%大肠癌肝转移和94%的大肠癌肺转移病例。


肿瘤预后分析

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DNA甲基化与肿瘤预后分析

    研究人员分析了甲基化图谱对每类癌症的预后评估能力(Circulating tumour DNA methylationmarkers fordiagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma)。在构建模型时,临床和人口学特征都被纳入分析范围,因为年龄,性别,种族以及美国癌症联合委员会的癌症分期等信息都可以提高预测能力。并且对于每种癌症类别,研究人员都使用两种不同的统计学习算法,lasso和boosting,有效地降低了标记物的维度。最后研究人员将预后模型应用在TCGA训练组和验证组,评估结果与经典生存分析Kaplan-Meier法一致,能够明确区分低风险组和高风险组(图3)。因此,甲基化图谱可进行预后和生存率的预测。

    甲基化可以预测不同癌症类型患者的总体生存率。(A)根据lasso算法的综合预后评分,得到的BRCA(乳腺癌)和LUAD(肺腺癌)患者的总体生存曲线(Cox回归曲线和Kaplan-Meier)。(B)根据boosting算法的综合预后评分,得到的BRCA和LUAD患者的总体生存曲线(Cox回归曲线和Kaplan-Meier)。

肿瘤复发检测

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DNA甲基化与肿瘤复发检测

    近期一项研究显示,一种新型的化验方法可检测结直肠癌患者血液中的肿瘤DNA,发现肿瘤复发的早期征象,其检出率是现有标准方法的两倍。
    该检测方法发现,将近70%的复发病人血液DNA中存在甲基化的BCAT1和IKZF1基因。而目前用于结直肠癌术后病人肿瘤复发监测的癌胚抗原(carcinoembryonic antigens, CEA)试验,阳性率只有32.1%。

该项研究的共同作者之一,弗林德斯大学的Graeme Young教授指出, 结直肠癌复发率很高,初步治疗后达到临床缓解的结直肠癌患者复发率为30-40%。其中,大部分病人是在治疗后2-3年内复发。全球每年死于结直肠癌的病人高达60万。因此,早期监测肿瘤复发方法的改进无疑可以拯救更多人的生命。这项研究将在Cancer Medcine杂志发表。此外,Young教授和他的同事,弗林德斯大学的Erin Symonds教授,还将在澳大利亚胃肠病学周会(Australian Gastroenterological Week Conference)上展示他们的发现。
    该项发现与既往的研究一致,在结直肠癌患者的血液中检测肿瘤来源的DNA是可靠的。此外,这些数据显示,BCAT1/IKZF1检测可用于临床缓解病人的长期监测,阳性患者进一步做影像学检查,可能更早地发现肿瘤复发的征象。

肿瘤溯源

Health care

DNA甲基化与肿瘤溯源


原发灶不明转移癌( Carcinoma of unknown primary,CUP)占所有肿瘤病例的3-9% ,死亡率高居第四位,CUP患者的预后很大程度上取决于原发肿瘤的生物学特性。因此找出肿瘤的组织起源,对于改善患者预后具有重要意义。

研究人员利用3个肿瘤数据库,分析了约2800个肿瘤样本和约590个相应正常组织的DNA甲基化水平,肿瘤样本包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌4种常见恶性肿瘤。研究人员发现,利用特定位点DNA甲基化水平的差异,在3个数据库中区分正常组织和肿瘤组织的准确率超过95%,与传统的诊断方法相当,但样本仅需少量,且过程更加简单快捷。更重要的是,利用结直肠癌特异性的DNA甲基化标记,可准确识别97%的结直肠癌肝转移病灶和94%的结直肠癌肺转移病灶。

研究人员指出,由于约10%的肿瘤首先表现为转移性病灶,其中一部分经过各种检查,原发病灶始终未知,所以DNA甲基化标记能够准确判断肿瘤的组织来源,这对于肿瘤的早期发现具有重大意义。在一份科研报道中研究者说:“这种方法的一大优势在于只需要少量的组织即可获得足量的DNA用于分析,这将减少组织活检造成的损伤,并降低病理诊断对活检组织结构的依赖,或能允许使用未知原发肿瘤来源的转移病灶组织进行检测。”同时还表示,虽然他们的研究目前只报告了4种最常见的恶性肿瘤,但预计相关DNA甲基化检测技术可以很容易地扩展到更多常见肿瘤的诊断。



DNA甲基化在肿瘤临床应用

      基因组外遗传(epigenedc)机制与基因突变等基因遗传性变化对肿瘤的形成有同样的地位,DNA甲基化(methylation)为重要的外遗传机制。DNA启动子高甲基化与抑癌基因转录失活有一定的关系,而DNA低甲基化与癌基因的过度表达有关,DNA甲基化也可导致点突变,这些与肿瘤的形成显著相关。DNA甲基化(ctDNA)可作为肿瘤早期诊断辅助诊断的标记物,DNA甲基化(ctDNA)也可作为治疗监测、复发检测的标志物。

       近年来,肿瘤液态活检被认为是肿瘤精准诊疗最有潜力的方法之一,而ctDNA(cell-free circulating tumor DNA)甲基化高灵敏度检测使得肿瘤早期发现变为可能。美国FDA已经批准结“直肠癌血浆游离SEPT9甲基化检测试Epi procolon”,“结直肠癌粪便脱落细胞BMP3,NDRG4甲基化检测试剂(cologuard)”。近日,今日,致力于早期诊断癌症的GRAIL公司宣布,该公司开发的多癌种液体活检测试获得美国FDA授予的突破性医疗器械认定。这一检测将被用于在50岁以上人群中早期检测多种癌症类型。

Detection Technolog of DNA Methylation

DNA甲基化检测技术

标题
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  • 二代测序

    二代测序

    一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,可对一个物种的基因组、转录组和部分基因panel进行测序,也可对DNA模板进行深度测序(Deep Sequencing),以检测出隐藏在背景信号中的超低阳性拷贝。

  • 甲基化特异PCR(MS-PCR)

    甲基化特异PCR(MS-PCR)

    甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MS-PCR)是一种特异位点甲基化检测技术,其基本原理是用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,根据目的基因修饰前后的改变,可设计检测引物、探针。本检测方法灵敏度高,特异性好,检测成本低,检测周期短。

  • 核酸质谱(MALDI-TOF MS)

    核酸质谱(MALDI-TOF MS)

    样品中未甲基化的C最终变为A,而甲基化的C最终变为G,然后质谱可根据G和A之间16 Da的分子量差异检测出甲基化和未甲基化的C并通过各自的峰面积计算该CpG位点甲基化比例,并估算整个检测片段内的平均甲基化水平。由质谱带来的这种快速、准确、定量甲基化检测新技术有助于推进肿瘤发生机制的研究,提升临床诊疗水平。

亚硫酸氢盐修饰技术


亚硫酸盐处理是甲基化检测最经典、最常用,也是最为稳定的上游处理技术,处理完可以区分出CpG带甲基化与没有带甲基化的DNA序列,亚硫酸盐处理后使用二代测序(NGS)、QPCR检测。

    亚硫酸盐不与带有甲基化集团的胞嘧啶和其他碱基反应,但是可与没有甲基化集团的胞嘧啶反应,反应生成易于发生脱氨基作用的磺化的胞嘧啶反应中间物,得到可在碱性条件下脱下磺酸基成为尿嘧啶的磺化尿嘧啶。磺化尿嘧啶与胸腺嘧啶有碱基配对行为,而5-甲基-胞嘧啶具有胞嘧啶的碱基配对行为,这样CpG带甲基化的C与G配对,CpG中与没有带甲基化C变为U与T配对,从而可以区分出DNA的CpG是不是带甲基。

常见问题1:亚硫酸氢盐修饰的转化率?

常见问题2:亚硫酸氢盐修饰的DNA降解问题?

常见问题3:亚硫酸氢盐修饰的DNA为单链还是双链?

Research Progress 

研究进展

Nature:基于DNA甲基化的早期癌症检测
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Nature:基于DNA甲基化的早期癌症检测

加拿大玛格丽特公主癌症中心和多伦多大学的研究人员近日开发出一种新方法,能够通过甲基化DNA实现癌症的早期检测。尽管这些结果还有待更多独立样本的验证,但他们认为这有望催生非侵入性的新型癌症筛查检测。


《Nature Materials》有关ctDNA甲基化标志物早期诊断和预测肝癌预后的研究
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《Nature Materials》有关ctDNA甲基化标志物早期诊断和预测肝癌预后的研究

    2017年10月9日,研究者在国际学术权威刊物自然出版集团旗下《Nature Materials》杂志(影响因子39.737)在线发表了题为“Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma”的研究成果。

    该研究发现,通过对少量(4~5ml)外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)特定位点甲基化水平的检测,可以对肝癌进行准确的早期诊断及疗效和预后预测。


Genome-Wide Analysis of DNA Methylation

全基因组甲基化测序

Hydroxymethylation 

羟甲基化

NEWS CENTER

DNA甲基化在临床应用

        WGBS(Whole-genome bisulfite sequencing)被视为甲基化测序的“金标准”。其原理是用 Bisulfite 处理,将基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 U,进行PCR扩增后变成T,与原本具有甲基化修饰的 C 碱基区分开来,再结合高通量测序技术,与参考序列比对,即可判断 CpG/CHG/CHH 位点是否发生甲基化,特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组 DNA 甲基化图谱。结合全基因组生物信息数据分析技术,进行低成本、高效率、高准确度的全基因组DNA甲基化水平图谱绘制。


       5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是新发现的一种的修饰碱基,以低水平存在于哺乳动物的多种细胞类型中。5hmC10-11易位(TET)家族的酶通过氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(MBD)与甲基化DNA的亲和性,具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能,而且参与了DNA去甲基化过程。因此关于5hmC的研究日益受到学者们的青睐,随着5hmC甲基化分析和检测方法学日益发展,发现5hmC分布具有组织特异性,并且5hmC在肿瘤组织中含量显著降低,可能成为某些肿瘤早期诊断的分子标志物。


SEPT9甲基化与结直肠癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

SEPT9、HOXA11甲基化与胃癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

SDC2甲基化与结直肠癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

NDRG4/BMP3甲基化与结直肠癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

SHOX2/RASSF1A甲基化与肺癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

GSTP1甲基化与前列腺癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

RASSF1A、P16甲基化与膀胱癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

SOX1、PAX1甲基化与宫颈癌

参考消息网11月8日报道英媒称,北京已完成建造全球最大的海

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